Optimierungsstudie zum nachgeschalteten Reinigungsprozess der Hühnerembryo-Ernteflüssigkeit für Typ-IV-Influenzaviren (Teil 1)

Influenza (auch Grippe genannt) ist eine hochansteckende Infektionskrankheit der Atemwege, die eine Vielzahl von Atemwegserkrankungen verursachen kann. Nach zuverlässigen Daten der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind jedes Jahr etwa eine Milliarde Menschen von Influenzaviren bedroht. Influenzaviren (IVs) gehören zur Familie der Orthomyxoviridae und sind einzelsträngige RNA-Viren mit negativem{3}}Sinn. Influenzaviruspartikel sind kugelförmig mit einem Durchmesser von 80–120 nm und ihre Struktur kann von außen nach innen in drei Schichten unterteilt werden: eine Hülle, Matrixproteine ​​und einen Kern.

 

Struktur der Influenza A- und B-Viren

Antivirale Medikamente und direkte Impfungen gegen Influenza sind entscheidende Schritte in der aktuellen Behandlung und Prävention von Influenza. Derzeit werden Hühnerembryo-Matrix und Zellmatrix häufig in der Influenza-Impfstoffforschung verwendet, wobei Hühnerembryonen von Forschern im In- und Ausland am häufigsten für die Herstellung von Influenzavirus-Flüssigkeit gewählt werden. Die Flüssigkeit des Allantoisvirus von Hühnerembryonen enthält zahlreiche Verunreinigungen, wie Ovalbumin und virale Strukturproteine. Ovalbumin ist ein wesentlicher Bestandteil, der bei geimpften Personen allergische Reaktionen hervorrufen kann. Daher sind die Klärung, Konzentration und Reinigung der Flüssigkeit des Allantoisvirus von Hühnerembryonen wesentliche Schritte bei der Entwicklung von Influenzavirus-Impfstoffen.

Derzeit ist die am häufigsten verwendete Technologie zur Klärung von Virusernteflüssigkeit Zentrifugation + Tiefenfiltration. Zu den wichtigsten Methoden zur Reinigung von Influenzaviren gehören Ultrafiltration, Ultrazentrifugation, Gelfiltrationschromatographie und kombinierte Chromatographie.

Ziel dieser Studie ist es, die Infektionseigenschaften von vier Influenzaviren-H1N1, H3N2, BV und BY-in 9–11 Tage alten Hühnerembryonen zu untersuchen. Monovalente virale Allantoisflüssigkeit wurde durch Hühnerembryokultur gewonnen, um ein Grundmaterial für die anschließende virale Verarbeitung bereitzustellen. Während der Studie wurden verschiedene Klärungs-, Konzentrations- und Reinigungsmethoden verglichen, um die Trennung des Zielproteins von anderen Komponenten (wie verschiedenen Proteinen und Ovalbumin) zu optimieren.

Roadmap für experimentelle Technologie

Hühnerembryonen wurden 9–11 Tage lang bei 37 Grad kultiviert. Anschließend wurden sie mit dem Influenza-A-Virus (A1 für H1N1, A3 für H3N2) mit einer MOI von 1:10.000 und dem Influenza-B-Virus (B1 für BV, B2 für BY) mit einer MOI von 1:10.000 geimpft. H1N1- und H3N2-Viren wurden 48 Stunden lang bei 33–34 Grad kultiviert, während BV- und BY-Viren 7,2 Stunden lang bei 33 Grad kultiviert wurden. Anschließend wurden die Embryonen abgekühlt und die Allantoisflüssigkeit entnommen. Die Allantoisflüssigkeit hatte einen hohen Gesamtproteingehalt, eine hohe Viskosität und wirkte trübe, was die Klärung erschwerte.

Auswirkungen verschiedener Klärverfahren auf die Qualität der Influenzavirus-Ernteflüssigkeit vom Typ IV

Die Klärung ist ein wesentlicher Schritt im Reinigungsprozess und dient der Vorbehandlung einer Vielzahl unlöslicher Verunreinigungen. Bei diesem Schritt wird Allantoisflüssigkeit als Rohmaterial verwendet. Nach der kontinuierlichen Hochgeschwindigkeitszentrifugation wird die Flüssigkeit geklärt und durch Filterpatronen mit Porengrößen von 3 μm und 0.8+0.45μm sowie 3 μm und 0.8+0.65μm gefiltert. Die Auswirkungen der beiden Filterpatronengrößen auf den Klärprozess und die Ergebnisse werden untersucht und ein geeignetes Klärschema ausgewählt, um den optimalen Klärprozess zu ermitteln.

Die Ergebnisse der vier Arten von Influenzavirus-Klärflüssigkeitstests sind in den Abbildungen dargestellt. 1-3 . CA1-1 stellt die Ergebnisse der mit 3μm- und 0.8+0.65μm-Filterkartuschen getesteten Klärflüssigkeit dar, CA1-2 stellt die Ergebnisse der mit 3μm- und {{6}μm-Filterkartuschen getesteten Klärflüssigkeit dar, und der Rest ist ähnlich.

Abbildung 1. Nachweisergebnisse der mit Influenzaviren geklärten Lösung - Gesamtproteingehalt

Abbildung 2. Nachweisergebnisse der mit Influenzaviren geklärten Lösung - Hämagglutinationstiter

Abbildung 3. Nachweisergebnisse der mit Influenzaviren geklärten Lösung - Gesamtproteinentfernungsrate

Die Ergebnisse zeigten, dass es zwischen den Gruppen zwar zahlenmäßige Unterschiede im Gesamtproteingehalt und in der Gesamtproteinentfernungsrate gab, es jedoch keine signifikanten Unterschiede gab. Dies kann daran liegen, dass die Porengrößen der Filterpatronen zu klein waren und alle die Reinigungsanforderungen erfüllen konnten. Bezüglich des Blutkoagulationstiters zeigten die 3μm- und 0.8+0.45μm-Filterkartuschen höhere Blutkoagulationstiter. Daher wurden für eine optimale Klärung die kleineren Porengrößen der 3μm- und 0.8+0.45μm-Filterkerzen ausgewählt.

Referenzen: Huang, Zhentian. Optimierung des nachgelagerten Produktionsprozesses für den quadrivalenten Influenzavirus-Split-Impfstoff [D]. Shenyang Agricultural University, 2024. DOI:10.27327/d.cnki.gshnu.2024.001595.